之前写过许多有关新冠核酸检测试剂注册相关文章，本文从科普角度，一方面为大众介绍新冠核酸检测试剂（荧光PCR法）注册产品，另一方面为已取得新冠核酸检测试剂（荧光PCR法）注册证的生产企业，说说生产注意事项。

新冠核酸检测试剂（荧光PCR法）注册及生产注意事项：

1、概述

新型冠状病毒(2019 -nCoV)是一种具有急性呼吸道传染性的RNA病毒，其直径在100 nm左右，有四种主要的结

构蛋白:刺突蛋白(Spike protein, S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid, N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein, M蛋白)，包膜蛋白(Envelope protein, E蛋白)。N蛋白在冠状病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。目前已获证的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂主要针对的靶标包括ORF1ab基因，E基因和N基因，其反应原理以实时荧光PCR法为主流方法学。

新型冠状病毒(2019-nCoV) 核酸检测试剂(荧光PCR法)的基本原理是以新型冠状病毒(2019-nCoV)的特异性基因(包括ORF1ab基因、E基因和N基因)设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对新型冠状病毒(2019-nCoV) 核酸的检测。临床样本核酸提取后，进行一步法RT-PCR扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线。同时设置内参照，主要对样本采集、保存和运输以及核酸提取过程进行监控，避免假阴性结果的判。

2、产品组成(以某获证产品为例)

通常由核酸扩增反应液、酶混合液、PCR检测混合液、阳性对照和阴性对照组成( 见图2)。扩增反应液中一般包含镁离子、核苷酸混合液等扩增中必需的原料及缓冲液成分;酶混合液通常是各种酶的集合(如: DNA/RNA聚合酶、逆转录酶、UNG酶等) ; PCR 检测混合液包括针对不同基因以及内参基因的引物/探针，根据不同企业设计验证的结果，组分的名称及具体成分可能略有差异，比如可能存在dNTPs等原料与引物/探针配制于同一管检测液中的情况;阳性对照是含有特异性片段的病毒样颗粒，阴性对照通常是生理盐水或样本保存液。

3、预期用途

主要用于体外定性检测新型冠状病毒肺炎疑似病例、其他需要进行新型冠状病毒感染诊断或鉴别诊断者的鼻咽拭

子、口咽拭子、痰液样本等中，新型冠状病毒(2019-nCoV)的0RF1ab、N基因和E基因。部分企业已获证产品只针对其

中某一种或两种基因。有关“疑似病例”等人群的定义参照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》、《新型冠状病毒肺炎防控方案》 等文件执行。在使用上应当遵守《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》、《新型冠状病毒肺炎防控方案》等文件的相关要求。开展新型冠状病毒核酸检测，应符合《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》等的要求，做好生物安全工作。最终的检测结果仅供临床参考，不得作为临床诊断的唯一标准。建议结合患者临床表现和其他实验室检测对病情进行综合分析。

4、规格型号

因体外诊断试剂产品的工艺特殊性，最终成品的规格区别通常在于分装体积或检测人份数的不同，如: 50人份/盒、

96人份/盒等。

5、产品性能(以某获证产品为例)

5.1外观

在自然光下以正常视力或矫正视力目视检查,试剂盒各组分齐全，标签字迹清晰，说明书内容完整、详细，外包装盒完整。澄清均一液体，无肉眼可见浑浊或不溶性杂质。

5.2阳性参考品符合率

按试剂盒说明书要求检测国家阳性参考品，应符合相应规定。或检测企业制备的阳性参考品P1-P5，结果均为阳性。

5.3阴性参考品符合率

按试剂盒说明书要求检测国家阴性参考品，应均为阴性。或检测企业制备的阴性参考品N1-N12，结果均为阴性。

5.4精密度

按试剂盒说明书要求检测国家精密性参考品, 10次检测结果均为阳性，且Ct值的变异系数(CV, %)应不高于5.0%。或检测企业参考品中的精密度参考品3份(J1、 J2和J3)，重复检测10次,计算精密度参考品J1.J2检测结果FAM/VIC(HEX)通道的Ct平均值x和标准偏差SD,按式(1)计算变异系数CV，结果应不大于5. 0%; J3检测10次结果均为阴性。

5.5最低检出限

按试剂盒说明书要求检测国家灵敏度参考品S，将其使用无RNA/DNA酶的去离子水进行1:3倍比稀释(2份水+1份样本，后同)后，将1:9、1:27、1:81. 1:243、1:729、1:2187.1: 6561、1:19683、 1:59049、 1:177147 分别标记为S1 ~S10,检测结果S1^ S3应为阳性。或按试剂盒说明书要求检测企业参考品中的最低检出限参考品1份(L)，重复检测3次，结果均为阳性。

8、关键原材料及性能要求

该类产品的主要原材料包括引物、探针、酶、dNTP、核酸分离/纯化组分(如有)、质控品、参考品等。如主要原材料源于外购，供应商应固定，不得随意更换。如主要原材料为企业自制，应能提供其详细制备过程。

8.1引物和探针

质量标准应至少包括序列准确性、纯度、浓度及功能性实验等。

8.2 dNTP

包括dATP、dGTP、 dCTP、 dTTP、 dUTP (如有)，质量标准应至少包括纯度、浓度、功能性等。

8.3酶

需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆转录酶、尿嘧啶DNA糖基化酶(如有)等，质量标准应至少包括对酶活性和功能性等的验证。

8.4质控品

试剂盒一般包含阴性质控品和阳性质控品。阳性质控品应包含试剂盒检测的靶序列，可采用假病毒制备。质量标准中应对质控品的检测结果Ct值范围做出明确的要求。

8.5内标

又称内对照，可对管内抑制导致的假阴性结果进行质量控制，应与靶核酸一同提取及扩增。质量标准中应明确内标的检测结果Ct值范围。

8.6企业参考品

一般包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性参考品。企业参考品应优先采用临床样本，或者使用病毒培养物加入阴性基质。无法获得临床样本或病毒培养物企业需说明其合理性。质量标准应包括功能性检测等。应根据产品性能验证的实际需要设置企业参考品。建议如下:

1)阳性参考品:着重考虑不同来源的病毒样本和浓度要求，至少选取不同来源的5个病毒样本。

2)阴性参考品:一般包括冠状病毒(HKU1 .0C43、NL63、229E)、SARS冠状病毒(可采用假病毒)、MERS冠状病毒(可采用假病毒)、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。不适用的阴性参考品企业需说明其合理性。

3)检出限参考品:可采用95%阳性检出水平或略高于检出限的水平，如100%阳性检出水平。

4)重复性参考品:一般包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。

9、质量控制点

9.1 PCR检测混合液的配制;

9.2核酸扩增反应液的分装(如有) ;

9.3酶混合液的分装;

9.4 PCR检测混合液的分装;

9.5阴性对照的分装;

9.6阳性对照的配制;

9.7阳性对照的分装。

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